콜라겐 펩타이드 섭취 무모생쥐에서 UVB 조사에 의한 피부 손상에 미치는 효과 규명

   * Corresponding Author : Jae Sung Hwang(Kyung Hee University) Tel: +82-31-888-6179 email: Received January 8, 2016 Revised (1st January 29, 2016, 2nd February 26, 2016) Accepted March 3, 2016 Published March 31, 2016

   피부는 신체를 보호하고, 수분과 온도를 조절 및 보존 하여 항상성을 유지하는 중요한 역할을 한다 [1]. 피부는 여러 가지 위험한 요인에 항상 노출되어 있는데, 외적인 요인으로는 자외선 (ultraviolet, UV), 환경오염 등이 있 고 내적인 요인으로는 면역기능 억제, 표피항상성 불균 형, 호르몬 변화, 연령 증가, 스트레스, 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 등이 있다. 이런 요인들 은 주로 피부 손상을 일으켜 피부의 본래 기능을 감소시 킨다 [2, 3, 4].피부 노화는 복잡한 생물학적 과정이 진행되 는 현상으로 시간 흐름에 따라 발생하는 노화인 내인성 노화와 자외선 노출에 의해 발생하는 외인성 노화인 광 노화 (photoaging)로 분류된다 [5, 6, 7]. 그 중 광노화에서 주름 생성, 색소 침착, 표피 두께 증가, 피부 탄력성 감소 및 피부 장벽 손상으로 인한 피부수분량을 감소 등이 발 생된다 [8, 9, 10]. 또한, 피부의 장력과 강도를 유지하여 외 부 자극으로부터 피부 보호 역할을 하는 단백질 콜라겐 (collagen) 양을 감소시킨다 [11, 12, 13]. Matrix metalloproteinase (MMP)는 아연에 의존하는 엔도 펩티다아제로서 콜라겐 분해 뿐만 아니라 세포 외 기질의 리모델링에 관여하며, 형태형성, 피부 궤양 및 종 양의 침윤과 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [14, 15, 16]. MMP는 자외선 노출에 의해 발생하는 활 성산소종에 의해 발현 유도가 되고, 발현 후에 세포외 기 질 (extracellular matrix, ECM)의 주요 성분인 콜라겐과 탄력섬유 (elastin)를 분해하여 세포외 기질의 구성성분 을 변형시켜 주름을 형성한다. MMP는 총 다섯 종으로 구성되어 있는데 collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane Type MMP, matrilysin이며, 구조 및 기질 특 이성으로 구분 할 수 있다 [14, 17]. 콜라겐 펩타이드 (collagen peptide)는 생선 비늘, 돈 피 및 우피에서 고분자 콜라겐을 추출, 가열하여 젤라틴 으로 변환시킨 후 가수분해를 통해 얻은 물질이며, 체내 에 들어가면 효소에 의해 아미노산으로 분해되지만 비타 민C에 의해 콜라겐 펩타이드로 재합성 된다. 이전 연구 에 의해 콜라겐 펩타이드가 피부 보습 및 탄력 개선과 주름을 예방하는 효능이 있다는 것이 보고되었고 피부 기능성 화장품에도 적용되고 있다 [18]. 또한, 최근 연구 에서는 고분자 콜라겐 펩타이드의 문제점으로 분자량이 커서 복용시 위장 내에서 쉽게 분해되어 피부에 영향을

   미치지 못하기 때문에 저분자 콜라겐 펩타이드를 개발하 고 피부의 보습 및 주름 억제에 고분자 콜라겐 펩타이드 보다 효능이 더욱 좋다는 것이 보고되었다 [16]. 본 연구에서는 Tilapia fish에서 유래된 콜라겐 펩타 이드 (TFCP)의 광노화 보호 효능을 알아보기 위해 무모 쥐 (hairless mouse) 동물 모델을 이용하여 연구를 진행 하였다. 광노화를 유도하기 위해 자외선을 조사 후 TFCP를 경구투여로 섭취시키고 주름을 나타내는 지표, 피부 두께, 수분량 등을 평가하고, MMP 발현 및 콜라겐 구성성분인 하이드록시프롤린 (hydroxyproline)의 양 등 을 확인하여 TFCP의 효능을 확인하였다.

   2.1 실험 재료 실험에 사용한 콜라겐 펩타이드 (KER-30DR, manufactured by Nitta Gelatin India Limited Co., Cochin, India)는 Tilapia fish (Oreochromis mosambicus) 의 scale 로부터 추출, 효소분해한 것으로 주영엔에스 (주)로부터 공급받아 사용하였다. 2.2 실험동물 및 사육관리 생후 6 주령 20-25 g 정도의 특정병원체 부재 (Specific pathogen free, SPF) 암컷 hairless mice (SKH-1:HR-a) 를 오리엔트 바이오 (Seongnam, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 검역과 일주일 의 순화 기간을 거치고 11마 리씩 4그룹으로 군을 분리 한 이후에 실험을 진행하였 다. 실험동물 사육환경은 온도 (24 ± 2°C), 습도 (55 ± 10%), 그리고 명암주기 12 시간을 유지 하였다. 사료는 마우스 전용사료 (Feed Lab Korea, Guri, Korea)를 급여 하였고. 실험동물 사육관리는 “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"를 기준으로 하였으며, 실험 은 경기과학기술진흥원 Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) 승인 하에 진행되었다 2.3 실험군 및 실험물질 경구투여 Normal군, UVB군, UVB + 545 mg/kg군, UVB + 1090 mg/kg군으로 실험을 진행하였다 (Table 1). Normal군과 UVB군은 물, UVB + 545 mg/kg군과 UVB + 1090 mg/kg 군은 TFCP 545 mg/kg, 1090 mg/kg의

   한 전압으로 1.5 시간동안 전기영동을 하였다. 전기영동 후 겔을 Zymogram renaturing buffer (Invitrogen)에 넣 어 30 분간 실온에 교반 후 버리고 Zymogram Developing buffer (Invitrogen)으로 교체 후 30 분간 실 온에서 교반하였다. 이후 새로운 Zymogram developing buffer로 교체 해주고 37°C에서 36 시간 동안 두었다. 36 시간 후에 겔을 Simply Blue TM Safe Stain (Invitrogen)으 로 2 시간 염색 후 D.W로 1 시간 단위로 2 번 탈색 시키 고 활성화 된 MMP-2, MMP-9을 확인하였다. 활성화 된 MMP-2, MMP-9은 62 kDa, 86 kDa에서 확인하였다.

   지 확인하기 위해 매일 관찰하고 체중을 주 1회 측정하였 다. 실험 기간 동안 모든 동물들의 체중은 증가한 것을 확인하였고 특이 증상 및 사망한 동물은 보이지 않았다. 체중 증가에 대한 유의한 변화는 보이지 않았다 (Fig. 1). 모든 동물 희생 후, 장기에 특이한 이상은 보이지 않았다. 3.2 TFCP가 광노화로 인한 주름 형성 억제에 미치는 영향 TFCP가 자외선 조사로 인한 주름 형성에 어떠한 영 향을 미치는지 알아보기 위해, 무모쥐 동물모델을 이용 하여 UVB를 조사하고 동물의 등쪽 부분 사진 촬영을 하여 주름을 관찰하였다 (Fig. 2). 레플리카를 이용하여 주름의 면적, 수, 길이, 깊이 등을 분석하였다 (Fig. 3A-E). 주름 지표인 주름 면적, 수, 길이, 깊이를 비교 분 석시, UVB군이 Normal군에 비해 모든 주름 지표가 증 가된 것을 확인하였고 TFCP 545 mg/kg 및 1090 mg/kg

   Effects of TFCP intake on wrinkle value of analyzed replica in UVB-irradiated hairless mice. (A) total wrinkle area (B) number of wrinkles (C) mean length (D) wrinkle depth (E) mean depth. Data are indicated as mean±SD of eleven mice in each group. ### p<0.001, ## p<0.01, # p<0.05 compared with non-UVB irradiated mice; ** p<0.01, * P<0.05 compared with UVB-irradiated mice.

   군은 UVB군에 비해 유의한 감소를 보였다. 이를 통하여 TFCP 섭취 시 UVB에의한 주름 생성에 대한 억제 효과 가 있다는 것을 확인하였다.
(A)
   (B) Effect of TFCP intake on skin thickness in UVB-irradiated hairless mice. (A) H&E staining (B) epidermis thickness. Data are indicated as mean±SD of eleven mice in each group. ### p<0.001 compared with non-UVB irradiated mice; *** p<0.001 compared with UVB-irradiated mice. 의하게 증가되었다 (Fig. 4A). 또한 UVB군에서 홍반이 유발되었고, TFCP 1090 mg/kg군에서 UVB군에 비해 유의하게 감소하였다 (Fig. 4B). 3.4 TFCP 섭취가 광노화로 인한 피부 두께 변화 및 콜라겐 생성에 미치는 영향 자외선 조사에 의해 피부 노화가 진행되면 피부 두께 가 두꺼워지고, 콜라겐 분해 효소가 활성화 되어 진피층 의 콜라겐 분해 촉진이 일어난다[20, 21]. 따라서, TFCP 가 UVB 조사 된 피부 두께 및 콜라겐에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 H&E 염색 및 Masson's trichrome 염색을 하여 분석하였다. H&E 염색 결과, UVB군이
(A)(B)
   Normal군에 비해 표피의 두께가 증가 하였고, TFCP 545 mg/kg 및 1090 mg/kg군은 UVB군에 비해 유의하게 감 소하였다 (Fig. 5A). NIS-Elements BR 3.0 Software를 이용하여 피부 두께를 측정한 결과 TFCP 545 mg/kg 및 1090 mg/kg군이 UVB군과 비교하여 유의하게 감소하였 다 (Fig. 5B). 피부 조직의 Masson's trichrome 염색 결 과에서도 UVB군은 Normal군에 비하여 콜라겐이 현저 하게 감소된 것을 관찰할 수 있지만, TFCP 545 mg/kg
(A)
   (B) Effect of TFCP intake on MMP-3, MMP-13 mRNA expression level in UVB-irradiated hairless mice. (A) MMP-3 mRNA expression (B) MMP-13 mRNA expression. Data are indicated as mean±SD of eleven mice in each group. ### p<0.001, ## p<0.01, # p<0.05 compared with non-UVB irradiated mice; ** p<0.01, * P<0.05 compared with UVB-irradiated mice. 및 1090 mg/kg군에서 콜라겐 양이 UVB군보다 증가 된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6A). 또한 콜라겐 필수구성 성분인 하이드록시프롤린도 TFCP 1090 mg/kg 군에서 UVB군보다 유의하게 증가되었다(Fig. 6B).

   섭취군에서 유의하게 감소하였다. 따라서, TFCP 섭취 시 콜라겐 분해효소인 MMP-2 및 MMP-9 의 발현을 감 소시키는 것을 확인 할 수 있다. 3.7 filaggrin 발현에 대한 TFCP의 효과 Filaggrin은 keratin-binding 단백질로서 각질층에 존 재하고 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다 [24]. 따 라서 TFCP가 UVB 조사에 의해 손상된 filaggrin을 다 시 회복시키는지 확인하기 위해 western blotting 방법 을 이용하여 확인하였다(Fig. 9). UVB군에서는 filaggrin 의 발현이 현저하게 감소되었고, TFCP 섭취군에서는 filaggrin의 발현량이 UVB군에 비해 증가되었다.따라서, TFCP 섭취시 UVB에 의해 손상된 filaggrin이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

   최근 식품 미용 소재로서 콜라겐 펩타이드는 중요한 소재로 평가 받고 있다. 이전에는 우피나 돈피 등 동물에 서 추출한 콜라겐을 이용하였지만 과정이 복잡하고 추출 되는 양이 적을 뿐만 아니라 위생 문제도 있어서 복잡한 추출 과정이 문제점으로 지적되었다 [11]. 이러한 문제 점을 해결하기 위해 다른 원료 소재를 탐색하고 있다. 이 중 어류 가공 부산물에서 나오는 껍질이나 뼈에는 콜라 겐이 다량 함유되어 있어 많은 양의 콜라겐을 얻을 수 있고 과정도 간단하기 때문에 동물 유래 콜라겐을 대체 할 수 있는 소재로 각광받고 있다 [25]. 최근 연구에서는 sutchi catfish 유래 펩타이드 섭취가 자외선에 의한 콜라 겐 펩타이드 분해 효소의 발현을 억제하여 주름 생성을 억제한다고 보고되었다 [16]. 본 연구에서는 무모쥐 동물모델을 이용하여 광노화에

   의해 유발되는 피부 주름 생성 및 손상에 Tilapia fish에 서 유래된 콜라겐 펩타이드(TFCP) 섭취가 어떠한 영향 을 미치는지 알아보았다. TFCP의 주성분은 glycine, proline, alanin 및 hydroxyproline으로 구성된 펩타이드 로서 기존의 보고와 같이 자외선에 의한 피부 손상을 억 제 할 가능성이 있으나, 현재까지 연구된 바는 없다.

   그 결과, TFCP는 UVB에 의해 생성되는 주름의 크기, 깊이, 길이, 주름의 수 및 홍반 생성을 감소시켰고, 피부 수분량은 증가되었다. 조직병리학적으로 관찰하였을 때, TFCP는 자외선에 의한 표피 두께의 증가를 억제하고 콜 라겐 손상을 막는 것을 알 수 있었다. 또한, 콜라겐 구성 에 필수요소인 하이드록시프롤린의 양도 TFCP 섭취 시 증가한 것을 확인할 수 있었다. TFCP의 작용기전을 알 아보기 위해 콜라겐 분해 효소인 MMP-3 및 MMP-13 mRNA발현량과 MMP-2 및 MMP-9 발현량을 확인한 결과, TFCP가 자외선에 의해 증가되는 MMP들의 발현 을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (Table 3). 또한, TFCP는 자외선에 의해 감소한 filaggrin의 단백질 발현 을 회복시킴을 확인할 수 있었다. 모든 결과를 종합해보 면 TFCP 섭취가 자외선으로부터 피부를 보호하여 콜라 겐 분해 효소 활성을 억제하여 최종적으로 주름 생성을 억제하고, 피부 손상을 보호하는 효능을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, Tilapia fish 유래의 콜라겐 펩타이드는 향후 광노화를 보호하는 식품 미용 소재로서 의 가능성이 높음을 알 수 있다.